Site Information

 Loading... Please wait...

Introduction to Reversible Binding

What is binding?

“The first step in essentially all biological activities is a union between separate constituents into a merged entity.”1 In the context of biochemistry, binding is the joining of two entities (molecules) that have some affinity for each other. This binding is almost always reversible, meaning the two molecules (generically known as ligand and receptor) will join together and come apart over and over again.

Binding Constants

Equilibrium
Receptor and ligand associate (bind), remain linked together for a while, and then dissociate (come apart). Eventually, an equilibrium state is reached such that the concentration of bound partners is no longer changing. Association and dissociation continue, but since the concentrations are no longer changing, the number of association events per second must equal the number of dissociation events per second.

Kinetics and Affinity
The rate at which the molecules associate is proportional to the concentrations of the molecules. If the concentration of either the ligand or the receptor is doubled, the rate of association is also doubled. Mathematically we write this as:

The term “kon” is a constant of proportionality and is known as the “on rate” for the particular receptor and ligand under study.

Likewise, the rate of dissociation is proportional to the concentration of the receptor ligand complex. The constant of proportionality "koff" is known as the “off rate”:

At equilibrium the rates are equal:

This equality allows for the ratio of the rate constants to be solved:

This ratio is called the equilibrium dissociation constant and is represented by the term Kd. It is closely related to the equilibrium association constant, which is represented by the term K, or sometimes Ka. Kd and K are the inverse of each other:

Historically, the term “affinity” referred strictly to the equilibrium association constant (K). Currently, binding constants are often given in terms of Kd rather than K. This is because the units of Kd are concentration (M) and therefore much more intuitive than inverse concentration (M-1), the units of K. Now the term “affinity” often refers to Kd instead of K. A colleague may say, “The affinity of this antibody is low nanomolar.” Obviously, the speaker is actually referring to the Kd rather than the K because the units are in terms of concentration. This distinction is being highlighted because of the ambiguity created when using the relative terms “high” and “low” associated with the term affinity. Ambiguity can be eliminated by using the relative terms “tight” and “weak” rather than “high” and “low” when speaking about affinity.

 

Binding Curves

A useful way to illustrate binding is to look at binding curves. Usually they are plots of either the free or bound fraction of one component, versus the concentration of the other component. The most useful type of plot is semilogarithmic (Figure 1).1

The equation to generate this plot only needs Kd and the total receptor concentration, [RT]. Depending on the values of Kd and [RT], the curve shape and location on the [LT] axis can change. By using the ligand concentration at 50% free receptor, [L50], as the location indicator, it can be described by the simple equation:2

The shape of the curve is completely defined by the ratio [RT]/Kd. A high ratio curve (above about 10) is called a concentration controlled curve, is steeper, and has a relatively sharp lower knee (Figure 2). A concentration controlled curve is mostly dependent on the concentration of receptor ([RT]) and has little dependence on Kd.

A low ratio curve (near or below 1) is called a Kd controlled curve, is less steep, and has a more gentle lower knee (Figure 3). A Kcontrolled curve is mostly dependent on Kd and has little dependence on receptor concentration.

This concept of ratio can be quite useful when designing experiments to ensure the outcome is sensitive to the variable of interest and less sensitive to other variables.

Equilibrium Binding Equations

At equilibrium the total association events equal the total dissociation events, so the equation may be written:

Where:
kon = association rate constant
[R] = free receptor site concentration
[L] = free ligand site concentration
koff = dissociation rate constant
[RL] = concentration of complex

Since Kd is koff/kon, equation (1) may be rewritten:

Receptor and ligand bind 1:1, such that total receptor equals receptor in complex plus free receptor. Two conservation of mass equations relate total material to equilibrium distributions:

Equations (3) and (4) are substituted into equation 2 (5):

Equation 5 is expanded (6a and 6b):

The terms are moved to one side (7):

Like terms are collected (8):

This is now a quadratic equation for free receptor at equilibrium, with the form:

The solution for [R] is either:

The positive root gives the only physically realizable solutions. Variables are filled in to the equation (9):

The equation is expanded and like terms are collected (10):

Both sides are multiplied by a common factor (1/[RT]) to get the equation in terms of free fraction or [R]/[RT] (11):

References

1. Klotz I.M. 1997. Ligand-receptor energetics: a guide for the perplexed. New York: John Wiley & Sons, Inc. https://books.google.com/Ligand-receptor energetics...

2. Ohmura N., Lackie S., Saiki H. 2001. An immunoassay for small analytes with theoretical detection limits. Anal Chem 73: 3392-3399. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11476240

  download.png

Einführung zu Reversibler Bindung

Was ist Bindung?

Der erste Schritt aller biologischen Aktivitäten ist eine Vereinigung von einzelnen Komponenten zu einer fusionierten Einheit.1 Im biochemischen Kontext heisst das, Bindung ist die Vereinigung von zwei Komponenten (Molekülen), die eine Affinität zueinander haben. Diese Bindung ist fast immer reversibel, was bedeutet, dass sich zwei Moleküle (allgemein bekannt als Ligand und Rezeptor) immer wieder vereinigen und auch wieder trennen.

Bindungskonstanten

Gleichgewicht
Rezeptor und Ligand binden aneinander, bleiben eine Weile verbunden, und dissoziieren wieder. Letztendlich wird ein Gleichgewicht erreicht, in dem sich die Konzentration der gebundenen Partner nicht mehr verändert. Assoziation und Dissoziation erfolgen weiterhin, aber da sich die Konzentrationen nicht mehr verändern, entspricht die sekündliche Anzahl der Assoziationen derjenigen der Dissoziationen.

Kinetik und Affinität
Die Rate, mit der die Moleküle assoziieren, ist proportional zu ihren Konzentrationen. Wenn die Konzentration des Liganden oder des Rezeptors verdoppelt wird, so verdoppelt sich auch die Assoziationsrate. Mathematisch formuliert:

Der Ausdruck „kon“ ist eine Proportionalitätskonstante, auch bezeichnet als „on rate“ für das spezielle Rezeptor-Liganden System.

Gleichermaßen ist die Dissoziationskonstante proporptional zur Konzentration des Rezeptor-Ligand Komplexes. Die Proportionalitätskonstante "koff" wird als "off rate" bezeichnet.

Im Gleichgewicht sind die Raten gleich:

Diese Gleichung lässt sich wie folgt umstellen:

Das Verhältnis entspricht der Dissoziationskonstante und wird durch Kd gekennzeichnet. Es ist der Assoziationskonstanten sehr ähnlich, die durch K gekennzeichnet ist, manchmal auch als Ka. Kd und K sind einander invers:

Historisch bezieht sich die Bezeichnung „Affinität“ strikt auf die Assoziations-Gleichgewichtskonstante (K). Heutzutage werden Bindungskonstanten jedoch häufig mit Kd anstatt mit K angegeben. Der Grund dafür liegt darin, dass die Einheit von Kd eine Konzentration (M) ist und somit wesentlich verständlicher als die inverse Konzentration (M-1), die Einheit von K. Die Terminologie „Affinität“ bezieht sich also nun meist auf Kd anstatt auf K. Ein Kollege könnte also sagen, „Die Affinität dieses Antikörpers liegt im niedrigen, nanomolaren Bereich“. Offensichtlich bezieht er sich auf Kd anstatt auf K, weil die Einheit in einer Konzentration angegeben wurde. Wir betonen diese Unterscheidung besonders, weil durch die alleinige Bezeichnung „hoch“ und „niedrig“ für die Affinität eine Mehrdeutigkeit, entstehen könnte. Diese Mehrdeutigkeit kann durch die Verwendung der Terminologie „fest“ und „schwach“ anstatt „hoch“ und „niedrig“ umgangen werden, wenn man über Affinität spricht.

 

Bindungskurven

Eine nützliche Art das Bindungsverhalten zu illustrieren zeigt ein Blick auf die Bindungskurven. Überlicherweise bestehen sie aus einer Graphik, wo entweder die freie oder gebundene Fraktion einer Komponente gegenüber der Konzentration der anderen Komponente dargestellt wird. Die geeignetste Darstellung ist semilogarithmisch (Abbildung 1).1

Um die Gleichung darzustellen, braucht man nur Kd und die gesamte Rezeptor Konzentration [RT]. Abhängig von den Kd und [RT]-Werten, kann sich die Kurvenform und die Position auf der [LT] Achse ändern. Durch die Verwendung der 50%igen, freien Ligandenkonzentration, [L50], ergibt sich folgende, einfache Gleichung:2

Der Kurvenverlauf wird komplett durch das Verhältnis von [RT]/Kd bestimmt. Eine Kurve mit grossem Verhältniswert (≥10) wird als konzentrationsbestimmt bezeichnet, ist steiler, und hat einen relativ scharfen unteren Knick (Abbildung 2). Eine konzentrationsbestimmte Kurve hängt hauptsächlich von der Konzentration des Rezeptors ([RT]) ab, und nur wenig von Kd.

Eine Kurve mit niedrigem Verhältnis (≤1) wird als Kd-abhängig bezeichnet, ist weniger steil und im unteren Teil runder (Abbildung 3). Eine Kd-kontrollierte Kurve hängt hauptsächlich von Kd ab und wird nur wenig von der Rezeptorkonzentration beeinflusst.

Dieses Konzept der Verhältnisbildung kann bei der Planung des Experiments sehr nützlich sein, um sicherzustellen, dass das Ergebnis sensitiv zu der Variabel ist, die den Experimentator besonders interessiert und nicht zur anderen.

Gleichgewichts Bindungskurven

Im Gleichgewicht entsprechen die gesamten Assoziationsereignisse denen der Dissoziation, so dass eine Gleichung folgendermassen formuliert werden kann:

Wo:
kon = Assoziationskonstante
[R] = freie Rezeptorkonzentration
[L] = freie Ligandenkonzentration
koff = Dissoziationskonstante
[RL] = Konzentration des Komplex

Da Kd = koff/kon ist, Gleichung (1), ergibt sich:

Rezeptor und Ligand binden 1:1, so dass die gesamte Rezeptorkonzentration derjenigen im Komplex plus freiem Rezeptor entspricht. Zwei Gleichungen, die das Gleichgewicht der Masse beschreiben, stellen die Beziehung von Gesamtmenge zu Gleichgewichtsverteilung her:

Gleichungen (3) und (4) werden in Gleichung 2 eingefügt, (5):

Gleichung 5 wird erweitert (6a und 6b):

Die Variablen werden auf eine Seite gebracht (7):

Gleiche Variablen werden zusammengestellt (8):

Dies ist nun eine quadratische Gleichung für den freien Rezeptor im Gleichgewicht:

Die Lösung für [R] ist entweder:

Die positive Wurzel ergibt die einzige mögliche Lösung. Variablen werden eingefügt (9):

Die Gleichung wird erweitert und gleiche Variablen zusammengestellt (10):

Beide Seiten werden mit einem allgemeinen Faktor (1/[RT]) multipliziert und nach der freien Fraktion umgestellt [R]/[RT] (11):

Referenzen

1. Klotz I.M. 1997. Ligand-receptor energetics: a guide for the perplexed. New York: John Wiley & Sons, Inc. https://books.google.com/Ligand-receptor energetics...

2. Ohmura N., Lackie S., Saiki H. 2001. An immunoassay for small analytes with theoretical detection limits. Anal Chem 73: 3392-3399. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11476240

  download.png